結(jié)果

抗菌肽在脂質(zhì)單層中的滲透

通過(guò)測(cè)量表面壓力的增量，觀察到抗菌肽在不同初始表面壓力（π0）下嵌入到空氣/水界面上的脂質(zhì)單層中(?π）將肽添加到亞相后（Brockman，1999；Verger和Pattus，1976）。Magainin 2在π0>12 mN/m時(shí)容易插入SOPC單層（圖1A），而在π0以上≈35 mN/m時(shí)，其在膜中的滲透被消除，因此該值表示該肽與SOPC膜相互作用的臨界包裝壓力πc。根據(jù)其凈正電荷4（Matsuzaki，1998），當(dāng)膜中酸性磷脂POPG的含量增加時(shí)，magainin 2向脂質(zhì)單層的滲透逐漸增強(qiáng)（圖1 A）。因此，消除magainin 2插入單層的πc值增加至~39（XPG=0.1）、43（XPG=0.2）和46 mN/m（XPG=0.4）（圖1c）。相反，在SOPC膜中加入膽固醇（Xchol=0.1）對(duì)magainin 2的滲透沒(méi)有顯著影響（圖1A）。

吲哚西丁的π也顯著增加，顯示其插入SOPC單層（圖1b）。然而，吲哚青素的膜活性明顯高于magainin 2，具有πc≈65mN/m，用于SOPC膠片。與magainin 2類(lèi)似，單層中POPG含量的增加增強(qiáng)了吲哚青霉素的滲透，增加了?π低于~38 mN/m，與肽和脂質(zhì)單層之間的靜電相互作用一致。然而，在后一個(gè)表面壓力值之上，吲哚西丁引起的π增量被POPG減弱。因此，與magainin 2相反，在存在POPG的情況下，πc減小（圖1c），在XPG=0.4時(shí)從~65 mN/m（對(duì)于SOPC單層）變?yōu)閪50 mN/m。在SOPC單層中，吲哚西丁增加的π也被膽固醇（X=0.1）增加，而πc降低至~54 mN/m。圖1所示的magainin 2和吲哚西丁的模式非常不同，后一種肽的明顯交叉點(diǎn)為~38 mN/m。

抗菌肽對(duì)雙層脂質(zhì)動(dòng)力學(xué)的影響

繼上述單層研究之后，有興趣探索肽對(duì)脂質(zhì)動(dòng)力學(xué)的影響。這是通過(guò)使用熒光光譜和不同脂質(zhì)成分的LUV完成的，記錄芘標(biāo)記的熒光磷脂類(lèi)似物PPDPC或PPDPG的發(fā)射光譜（均為X=0.01）。對(duì)于SOPC LUV，添加magainin 2導(dǎo)致芘熒光顯著猝滅，芘單體和準(zhǔn)分子發(fā)射強(qiáng)度平行降低，如Im所示（圖2）。作為XPG的一項(xiàng)功能，還研究了馬蓋寧2與脂質(zhì)體結(jié)合的后果。當(dāng)XPG從0.1增加到0.4時(shí)，觀察到由于magainin 2在398 nm處逐漸增強(qiáng)的Im（RFIm），而Im的初始增量在明確定義的PG/magainin 2化學(xué)計(jì)量比~2、3和5時(shí)趨于平穩(wěn)（圖2 A）。在這個(gè)初始階段之后，直到給定的化學(xué)計(jì)量比，還有第二個(gè)過(guò)程，其斜率也隨著XPG的增加而增加（圖2b）。在XPG=0和0.1時(shí)，Magainin 2僅引起Ie/Im的輕微變化，而在XPG=0.2和0.4時(shí)，分別減少10%和25%是明顯的（圖3 A）。為了區(qū)分脂質(zhì)動(dòng)力學(xué)中兩種性質(zhì)不同的變化，即側(cè)向遷移率和微結(jié)構(gòu)域形成，作為上述Ie/Im變化的根本原因，我們還通過(guò)測(cè)量DPH的熒光各向異性r來(lái)評(píng)估酰基鏈順序的變化（圖3 B）。在缺乏酸性磷脂的情況下，Magainin 2幾乎不會(huì)引起r的變化（圖3B）。然而，隨著XPG的增加，加入magainin 2后脂質(zhì)堆積和酰基鏈順序逐漸增加（圖3b），XPG=0.4時(shí)，r最大增加1.4倍。值得注意的是，XPG=0.1時(shí)Ie/Im沒(méi)有變化以及酰基鏈順序的增加表明PPDPG正在發(fā)生微觀富集。有趣的是，在存在膽固醇（Xchol=0.1）的情況下，由于馬蓋寧2的作用，Im和Ie都顯著降低，Ie/Im的變化不顯著（圖2A和3A）。如前所述（van Ginkel et al.，1989），添加肽前r的增加（圖3 B）揭示了通過(guò)在膜中摻入膽固醇而增強(qiáng)的膜順序。然而，在膽固醇存在的情況下，magainin 2對(duì)r沒(méi)有進(jìn)一步的影響（Xchol=0.1，圖3b）。

隨后，我們進(jìn)行了與上述相同的測(cè)量，但使用吲哚西丁。與magainin 2類(lèi)似，吲哚西丁也導(dǎo)致SOPC LUV的Im和Ie同時(shí)減少，如圖4a所示。然而，與magainin 2相反，當(dāng)存在酸性磷脂POPG時(shí)，芘熒光的猝滅也很明顯。當(dāng)肽/脂摩爾比為1/20時(shí)，Im按XPG?0.40.20.10順序下降。當(dāng)XPG=0.4且肽/脂摩爾比>1:12.5時(shí)，Im值進(jìn)一步降低。吲哚西丁引起的Im最大減量為15%（XPG=0）至40%（XPG=0.4）。盡管Im降低，但I(xiàn)e/Im未顯示因吲哚西丁引起的顯著變化（圖4b）。有趣的是，在Xchol=0.1時(shí)測(cè)量到Im的最大下降（圖4a）。與magainin 2類(lèi)似，當(dāng)吲哚西丁添加到SOPC LUV中時(shí)，DPH各向異性r保持不變（圖5a）。然而，在含有酸性磷脂的膜中，吲哚西丁導(dǎo)致脂質(zhì)堆積增加和酰基鏈順序增加，明顯表現(xiàn)為r增加（圖5a）。此外，r的增加取決于XPG，隨著雙層中酸性磷脂含量的增加而增加（圖5b）。相應(yīng)的最大增幅為1.05倍至1.39倍。在膽固醇存在的情況下，也觀察到吲哚肽引起的膜酰基鏈順序的增加，使r增加1.06倍（圖5a）。

抗菌肽對(duì)膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的影響

由于上述magainin 2和吲哚西啶對(duì)單層和LUV具有明顯的脂質(zhì)成分依賴性作用，因此有興趣使用巨型脂質(zhì)體比較這些肽對(duì)宏觀膜的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的影響，無(wú)論是否含有PG，都可以在交流電場(chǎng)中形成由SOPC組成的巨大脂質(zhì)體。即使暴露于大量肽（~2 fmol，~4 pl=200次重復(fù)注射，數(shù)據(jù)未顯示），SOPC膜也不受magainin 2的影響。同樣，由SOPC和膽固醇（Xchol=0.1）組成的巨大脂質(zhì)體也不受此量的馬蓋寧2的影響（數(shù)據(jù)未顯示）。然而，在存在POPG（XPG=0.1）的情況下，已經(jīng)~0.01 fmol（單次~20 fl注射）的magainin 2應(yīng)用于巨大囊泡表面，顯著影響巨大脂質(zhì)體膜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（圖6 B）。更具體地說(shuō)，在~1分鐘內(nèi)，小顆粒（θ≈0.9米）出現(xiàn)在巨大的囊泡內(nèi)。隨后注射高達(dá)~0.1 fmol（約200 fl）的magainin 2不會(huì)引起進(jìn)一步的可見(jiàn)變化。在總共添加約0.2 fmol的肽后，膜開(kāi)始起伏，形成致密顆粒（θ≈4 m）在巨大脂質(zhì)體內(nèi)可見(jiàn)（圖6 C）。在~5分鐘內(nèi)，幾個(gè)小顆粒（θ≈0.9 m）出現(xiàn)在巨大脂質(zhì)體膜的內(nèi)表面（圖6 D）。隨后，大多數(shù)小顆粒進(jìn)入巨大囊泡的內(nèi)腔。這些內(nèi)吞小泡似乎在巨大脂質(zhì)體內(nèi)自由移動(dòng)，在隨后30分鐘的觀察中沒(méi)有進(jìn)一步的變化。進(jìn)一步注射magainin 2，提供總共0.3 fmol的肽，引起類(lèi)似內(nèi)吞作用的過(guò)程，出現(xiàn)直徑約8 m的致密顆粒（圖6 E）。約10分鐘后，巨大脂質(zhì)體內(nèi)約0.9-m顆粒的數(shù)量繼續(xù)增加。偶爾，這些顆粒也出現(xiàn)在巨大囊泡的外表面，并釋放到外部緩沖液中（圖6 E）。隨后添加magainin 2（~0.7 fmol）使膜不穩(wěn)定并誘導(dǎo)進(jìn)一步的囊泡形成（圖6 F）。這些內(nèi)吞囊泡在巨大脂質(zhì)體內(nèi)彼此分離，巨大囊泡的大小明顯減小（圖6f）。最終，在進(jìn)一步添加magainin 2（高達(dá)~1.5 fmol）后，巨大的脂質(zhì)體膜崩塌。上述形態(tài)學(xué)變化具有高度的可重復(fù)性。

隨后，我們研究了吲哚西丁對(duì)由SOPC及其與POPG（XPG=0.1）的混合物組成的巨大脂質(zhì)體的影響。對(duì)于SOPC巨型脂質(zhì)體，唯一明顯的變化是在其表面應(yīng)用~2 fmol（~200次注射）吲哚西丁后出現(xiàn)輕微收縮（數(shù)據(jù)未顯示）。然而，當(dāng)囊泡含有POPG（X=0.1）時(shí)，吲哚西丁（~0.5 fmol）誘導(dǎo)類(lèi)似內(nèi)吞作用的過(guò)程（圖7），巨大脂質(zhì)體內(nèi)出現(xiàn)小顆粒（~0.9 m）。添加約0.5 fmol吲哚西丁（50次注射）后，暴露于吲哚西丁的巨大脂質(zhì)體表面區(qū)域變暗，折射率發(fā)生顯著變化，表明形成緊密堆積的三維結(jié)構(gòu)，僅部分保留在焦平面內(nèi)（圖7b）。小粒子（θ）≈在上述聚集體形成后約1分鐘內(nèi)，巨大脂質(zhì)體內(nèi)出現(xiàn)0.9 m（圖7 C）。隨后再添加0.1 fmol吲哚西啶后，膜表面的聚集物仍然存在，更多的小直徑顆粒出現(xiàn)在巨大的囊泡內(nèi)（圖7，DF）。這種類(lèi)似內(nèi)吞作用的過(guò)程在隨后添加吲哚西丁的情況下重復(fù)，大量小顆粒逐漸積聚在巨大脂質(zhì)體內(nèi)，并且巨大脂質(zhì)體的大小略有減小。

隨后，我們研究了吲哚西丁對(duì)由SOPC和膽固醇組成的巨大脂質(zhì)體（Xchol?0.1）的影響。吲哚西丁在膽固醇存在的情況下也會(huì)引起巨大脂質(zhì)體的起泡。形成的內(nèi)吞小泡在巨大小泡的表面上深度聚集（圖8b）。具體地說(shuō)，在添加約0.2 fmol吲哚西啶（~400 fl，20次注射，圖8 B）后約5 s內(nèi)，巨大脂質(zhì)體表面出現(xiàn)一簇小顆粒。隨后，聚集物轉(zhuǎn)移到巨大的脂質(zhì)體中，同時(shí)也有少量?jī)?nèi)吞顆粒（θ≈0.9米）處可見(jiàn)。進(jìn)一步添加吲哚西丁會(huì)增加這些顆粒的數(shù)量，并導(dǎo)致巨大脂質(zhì)體收縮。然而，即使在暴露于~2 fmol吲哚西丁（200次注射，數(shù)據(jù)未顯示）的情況下，膜大體上仍保持完整。

討論

馬蓋寧2和吲哚青霉素的膜活性

單層實(shí)驗(yàn)顯示，magainin 2和吲哚西啶具有高度的膜活性（圖1），在空氣/水界面上的脂質(zhì)膜下注射后，表面壓力顯著增加。根據(jù)膜的組成，發(fā)現(xiàn)了與表面壓力πc對(duì)應(yīng)的臨界堆積密度，超過(guò)該密度，這些肽不再與單層相互作用，從而導(dǎo)致π的增加（Verger和Pattus，1976）。盡管這兩種肽插入兩性離子磷脂酰膽堿單分子膜，但它們優(yōu)先與酸性磷脂相互作用，與其凈陽(yáng)離子電荷保持一致（Matsuzaki等人，1991、1993、1995a、1998；Ladokhin等人，1997）。然而，PG對(duì)其穿透力的影響明顯不同，吲哚西丁在~38 mN/m的表面壓力下有一個(gè)交叉點(diǎn)，吲哚西丁的斜率為?存在PG時(shí)，π與π0的比值變得更陡（圖1）。相比之下，斜坡??與π0相比，magainin 2的穿透力未因PG的存在而改變（圖1A）。我們的數(shù)據(jù)表明，magainin 2更表面地附著于單層，其穿透深度增加PG，并隨著表面壓力的增加而逐漸減小，其長(zhǎng)軸相對(duì)于層平面的角度在不同壓力下保持相對(duì)不變。上述magainin 2與脂質(zhì)單分子膜的相互作用模式可兼容1）其主要為=-螺旋構(gòu)象，PG增加=-螺旋度（Wieprecht et al.，1997），和2）該肽在其長(zhǎng)軸平行于層平面的情況下向脂質(zhì)雙層的淺層滲透（Bechinger等人，1993年；Matsuzaki等人，1994年）。在π>πc時(shí)，magainin 2仍可能與單層中的PG靜電結(jié)合，盡管沒(méi)有穿透膜，因此不會(huì)導(dǎo)致π增加。最后，我們的數(shù)據(jù)還表明，與雙層不同，magainin 2不會(huì)在脂質(zhì)單層中采用垂直方向（即其=-螺旋的長(zhǎng)軸垂直于層平面）。

對(duì)于測(cè)試的所有單層組成，吲哚青霉素的πc值超過(guò)了馬蓋寧2的測(cè)量值（圖1 c），表明該肽在酰基鏈之間有效插入和插層。吲哚西丁在~38 mN/m的交叉點(diǎn)值得關(guān)注。在后一個(gè)表面壓力之下，表面壓力的增量??在PG存在的情況下，吲哚西丁引起的反應(yīng)增強(qiáng)，而在較高的初始脂質(zhì)堆積密度下觀察到相反的反應(yīng)。有趣的是，不管脂質(zhì)成分（即PG的存在）如何，交叉點(diǎn)幾乎保持不變，因此表明它可以完全由表面壓力決定，而不管靜電相互作用如何。一種可能的機(jī)制是，在π0>38 mN/m時(shí)，吲哚西丁以壓力依賴的方式改變其在單層中的取向，可能是從其長(zhǎng)軸相對(duì)于層平面的平行到垂直取向（圖9，B和C），從而減少面積/肽并減少?π.此外，一些靜電結(jié)合吲哚肽的PG分子也可能與單層中的磷脂方向不同。換句話說(shuō)，吲哚西丁與其相關(guān)的PG將形成一種超分子復(fù)合物，其取向?qū)⑷Q于壓力。這在圖9中示意性地示出。重要的是，所提出的肽連接磷脂的重新定向?qū)⑴c最近提出的模型兼容，在該模型中，穿過(guò)雙層的孔表面的一部分將由脂質(zhì)頭基構(gòu)成（Ludtke et al.，1996）。

magainin 2和吲哚西啶對(duì)雙層脂質(zhì)動(dòng)力學(xué)的影響

雖然熒光光譜顯示，馬蓋寧2和吲哚西啶對(duì)脂質(zhì)動(dòng)力學(xué)的影響存在明顯差異，但也存在一些明顯的相似之處。因此，DPH各向異性r的增加表明，在存在酸性磷脂的情況下，這兩種肽都會(huì)導(dǎo)致酰基鏈順序的增加，這種影響的程度隨著XPG的增加而增加（圖3b和5b）。同樣，在膽固醇存在的情況下，兩種肽對(duì)芘熒光的有效猝滅也很明顯（圖2a和4a）。這可能與膽固醇的OH基團(tuán)和馬蓋寧的E19殘基之間的相互作用有關(guān)（Tytler等人，1995年），該肽在膜中具有跨膜取向。當(dāng)Xchol=0.1時(shí)，r值的增加是由于吲哚西丁所致，而馬加寧則無(wú)影響。這表明，在膽固醇存在的情況下，吲哚肽可能采用跨雙層取向，其長(zhǎng)軸垂直于雙層平面。

這兩種抗菌肽對(duì)芘標(biāo)記的磷脂類(lèi)似物的猝滅機(jī)制令人感興趣。可能涉及π-陽(yáng)離子相互作用（Dougherty，1996），后者由肽的堿性殘基表示。吲哚西丁具有較高的Trp含量（39%），可促進(jìn)其分配到脂質(zhì)雙層（Wimley和White，1996）。因此，芘和色氨酸之間的π-相互作用也是可能的。已經(jīng)證明，色氨酸可以淬滅膠束溶液中各種芘衍生物的熒光發(fā)射（Encinas和Lissi，1986；Altamirano等人，1998）。另一種可能性是鏈反轉(zhuǎn)（Holopainen et al.，1999），通過(guò)肽與脂質(zhì)雙層結(jié)合，導(dǎo)致芘部分調(diào)節(jié)到更極性的環(huán)境中，從而增加熒光團(tuán)微環(huán)境的極性，并導(dǎo)致量子產(chǎn)率降低。

除上述相似性外，當(dāng)使用芘標(biāo)記的脂質(zhì)類(lèi)似物研究酸性磷脂對(duì)脂質(zhì)動(dòng)力學(xué)的影響時(shí)，兩種肽之間也存在明顯差異。Magainin 2導(dǎo)致兩性磷脂組成的LUV的芘發(fā)射顯著猝滅（圖2A）。然而，在PG存在的情況下，芘的單體強(qiáng)度增加，XPG逐漸增加了這種效應(yīng)的幅度（圖2A）。圓二色性、拉曼光譜、傅里葉變換紅外光譜和固態(tài)核磁共振研究表明，馬蓋寧在與脂質(zhì)雙層結(jié)合時(shí)采用螺旋構(gòu)象（Matsuzaki等人，1989年、1991年；Williams等人，1990年；Jackson等人，1992年；Bechinger等人，1993年；Wieprecht等人，1997年；Hirsh等人，1996年）。magainin 2對(duì)兩種膜的這些不同影響可能是由于1）通過(guò)與肽的帶正電基團(tuán)（例如賴氨酸的?氨基）直接接觸使芘熒光猝滅，或2）插入雙層的=-螺旋肽改變熒光團(tuán)的微環(huán)境，與層平面平行，如上所述。然而，在PG存在的情況下，肽的正電荷應(yīng)在與酸性磷脂形成靜電復(fù)合物時(shí)被中和，從而減少由于π-陽(yáng)離子相互作用導(dǎo)致的芘熒光猝滅。

有趣的是，在存在酸性磷脂的情況下，肌動(dòng)蛋白/脂質(zhì)的摩爾比（在該摩爾比下，肌動(dòng)蛋白的初始增量趨于穩(wěn)定）分別為1:21、1:16和1:12.5，對(duì)應(yīng)于XPG=0.1、0.2和0.4（圖2A），分別產(chǎn)生1:2、1:3和1:5的肌動(dòng)蛋白/磷脂化學(xué)計(jì)量比。同時(shí)，DPH的初始r增量在magainin/脂質(zhì)摩爾比為~1:30、1:12和1:5時(shí)趨于平穩(wěn)（XPG分別為0.1、0.2和0.4），對(duì)應(yīng)于大約1:3、1:2.5和1:2的magainin/PG化學(xué)計(jì)量比（圖3）。據(jù)報(bào)道，在這些肽/脂質(zhì)摩爾比下，magainin可插入含酸性磷脂的膜中（Ludtke等人，1994年）。此外，已經(jīng)證明，雙分子層中magainin的=-螺旋的方向取決于肽與脂質(zhì)的摩爾比，在上述化學(xué)計(jì)量比下，螺旋應(yīng)垂直于膜表面插入，在含PG的膜中形成孔（Ludtke等人，1996）。這些孔不僅由兩親螺旋的極性面組成，而且還由脂質(zhì)的極性頭基組成，內(nèi)外單層通過(guò)這些孔襯脂質(zhì)是連續(xù)的。膜中的這種結(jié)構(gòu)可能會(huì)降低探針芘部分微環(huán)境的極性，從而提高其量子產(chǎn)率。有趣的是，當(dāng)XPG>0.1時(shí)，magainin 2逐漸降低Ie/Im值（圖3 A），這與增強(qiáng)的酰基鏈順序減少脂質(zhì)側(cè)向擴(kuò)散的速率一致。然而，由于magainin 2已經(jīng)在XPG=0.1時(shí)增加了r，Ie/Im沒(méi)有變化，我們可以得出結(jié)論，PPDPG探針向微區(qū)富集以及其橫向擴(kuò)散的減少正在發(fā)生。

與magainin 2類(lèi)似，吲哚青霉素與陰離子和兩性離子囊泡的膜結(jié)合非常不同（圖1b、4和5），與先前的平衡透析研究一致（Ladokhin et al.，1997）。雖然芘熒光的猝滅顯示吲哚肽被分配到SOPC雙層中，但對(duì)膜酰基鏈順序幾乎沒(méi)有影響（圖5）。相反，吲哚西啶與陰離子膜的相互作用導(dǎo)致脂酰鏈順序增加，明顯表現(xiàn)為DPH熒光各向異性增加，并對(duì)XPG呈S形依賴（圖5）。與magainin 2相反，吲哚西丁導(dǎo)致芘單體和準(zhǔn)分子發(fā)射強(qiáng)度顯著平行降低，與脂質(zhì)成分無(wú)關(guān)，Ie/Im變化較小（圖4）。相應(yīng)地，吲哚西丁誘導(dǎo)酸性PG富集到微區(qū)。有趣的是，在吲哚西丁/脂質(zhì)摩爾比為1:20以下，芘Im的減少順序?yàn)閄PG=0.40.20.10（圖4a），而在吲哚西丁/脂質(zhì)摩爾比為1:10時(shí)，Im的減少對(duì)XPG的依賴性相反。這種變化的可能機(jī)制如下。在低肽/脂摩爾比時(shí)，吲哚西丁似乎被調(diào)節(jié)到雙層界面（Ladokhin等人，1997），芘標(biāo)記鏈的鏈反轉(zhuǎn)（Holopainen等人，1999）使該部分更接近雙層表面，從而允許其與吲哚西丁的基本殘基接觸。后者通過(guò)π-陽(yáng)離子相互作用導(dǎo)致芘部分的碰撞猝滅。然而，隨著XPG的增加，我們可以預(yù)期PG頭基與吲哚西丁的堿性殘基發(fā)生靜電結(jié)合，從而阻止芘與吲哚西丁的陽(yáng)離子殘基之間的直接接觸。隨著肽濃度的增加，吲哚肽的膜結(jié)合以協(xié)同方式增強(qiáng)，猝滅效率的逆轉(zhuǎn)可能涉及雙分子層中脂肽復(fù)合物的聚集。因此，在酸性含磷脂的膜中，吲哚對(duì)芘的猝滅作用較小。當(dāng)吲哚肽的濃度增加到肽/脂比1:10以上時(shí)，肽將以高度協(xié)同的方式并入膜的酰基鏈區(qū)域（Ha等人，2000）（圖9 E），而在中性膜中，肽位于界面（圖9 D）。插入吲哚西丁的量取決于雙層中的XPG，導(dǎo)致吲哚西丁的Trp殘基的猝滅占主導(dǎo)地位，與XPG=0.4時(shí)Im的顯著減少一致（圖4a）。

馬蓋寧2和吲哚西啶對(duì)巨脂質(zhì)體的影響

細(xì)胞質(zhì)膜通透性被認(rèn)為是馬加寧和吲哚肽等肽的抗菌作用的原因（Matsuzaki，1998，1999；Sitaram和Nagaraj，1999），并提出了幾種機(jī)制模型（綜述見(jiàn)Bechinger，1999）。孔或通道的形成被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致跨膜電位的耗散和脂質(zhì)不對(duì)稱（Falla等人，1996年；Matsuzaki，1998年，1999年；Sitaram和Nagaraj，1999年）。Magainin 2和吲哚肽應(yīng)按照定義的結(jié)構(gòu)插入脂質(zhì)雙層，與所有疏水氨基酸形成構(gòu)象，形成一個(gè)表面，然后與膜的疏水核心接觸。因此，這些肽的膜插入迫使磷脂酰基鏈分開(kāi)。這些肽的抗菌作用還可能包括局部相變，如脂肽膠束從雙層分離，或由于插入肽引起膜曲率的局部變化，這可能導(dǎo)致雙層結(jié)構(gòu)的局部坍塌。在分子水平上，這些過(guò)程可能是本文報(bào)道的magainin 2和吲哚美辛誘導(dǎo)的巨大囊泡形成的基礎(chǔ)。magainin的裂解活性對(duì)靶膜的脂質(zhì)成分高度敏感，該肽優(yōu)先結(jié)合并滲透陰離子脂質(zhì)膜（Matsuzaki等人，1991、1993、1995a、1998）。因此，對(duì)微生物致死濃度的馬蓋寧不會(huì)裂解哺乳動(dòng)物細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞的質(zhì)膜外層不含帶負(fù)電的磷脂（Ma tsuzaki，1999）。大腸桿菌暴露于magainin會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌表面出現(xiàn)氣泡（Matsuzaki等人，1997年）。在本研究中，觀察到由馬蓋寧2和吲哚青霉素誘導(dǎo)的巨大脂質(zhì)體的囊泡形成，這代表了它們與脂質(zhì)雙層結(jié)合的更宏觀的變化。重要的是，酸性PG的存在是兩種肽產(chǎn)生囊泡所必需的。巨大脂質(zhì)體的囊泡形成需要反復(fù)應(yīng)用magainin 2，因此暗示了一種濃度依賴性作用機(jī)制。已經(jīng)證明，在存在magainin的情況下形成的孔隙是短暫的，具有有限的壽命（Matsuzaki等人，1995b）。當(dāng)附近的孔隙崩解時(shí)，可能形成肽和脂質(zhì)的超分子復(fù)合物，從而導(dǎo)致雙層的短暫破壞（圖6）。同時(shí)，一些肽分子應(yīng)該轉(zhuǎn)移到膜的內(nèi)部小葉中（Matsuzaki等人，1995a，1996），從而使膜重組和愈合。由于magainin 2而形成的內(nèi)吞小泡比胞吐更明顯（圖6），這可能與肽在雙層外表面的不對(duì)稱應(yīng)用有關(guān)。因此，巨大脂質(zhì)體的囊泡化可以緩解由于不對(duì)稱肽結(jié)合和隨后的膜膨脹而導(dǎo)致的雙層不利應(yīng)變。囊泡化可以降低剩余巨大脂質(zhì)體膜中的肽濃度，從而減少孔隙形成。隨后，需要繼續(xù)向膜中添加magainin 2以引起巨大脂質(zhì)體的進(jìn)一步囊泡化（圖6）。

吲哚西丁只含有13個(gè)氨基酸，因此太短，無(wú)法跨越雙層。然而，該肽可以作為聚集物或帶有相關(guān)酸性磷脂的頭尾二聚體橫跨雙層（圖9 E），從而導(dǎo)致膜不穩(wěn)定性。已經(jīng)證明，吲哚西丁能夠通過(guò)穿過(guò)外膜殺死革蘭氏陰性細(xì)菌，并通過(guò)形成通道破壞細(xì)胞質(zhì)膜（Falla et al.，1996）。與magainin 2的作用相比，吲哚青霉素誘導(dǎo)的內(nèi)吞小泡較小（圖7）可能反映了這些肽與脂質(zhì)相互作用的不同模式。一些吲哚肽分子可能會(huì)轉(zhuǎn)移到膜的內(nèi)部小葉中。除了具有廣譜的抗真菌和抗菌活性外，吲哚西丁對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞也有毒性（Schluesener等人，1993年；Ahmad等人，1995年）。有趣的是，吲哚西丁對(duì)SOPC和SOPC膽固醇巨型脂質(zhì)體的作用不同。在這一階段，根本原因尚不確定，可能與膽固醇對(duì)雙層結(jié)構(gòu)以及吲哚肽在膜中的取向的影響有關(guān)。因此，需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明膽固醇對(duì)吲哚肽膜結(jié)合的影響。

我們的結(jié)果表明，在帶負(fù)電荷的磷脂存在下，magainin 2對(duì)所用生物膜模型的作用顯著增強(qiáng)。除了膜負(fù)電荷外，肽/脂質(zhì)的化學(xué)計(jì)量也被證明是雙層中馬蓋寧組織的重要決定因素（Ludtke等人，1994）。在低肽/脂質(zhì)比率下，=-螺旋肽基本上平行于膜表面，并淺穿透膜的疏水核心（Bechinger等人，1993年；Matsuzaki等人，1994年）。該位置將脂質(zhì)頭基推到一邊，迫使疏水區(qū)域形成間隙，而膜變薄以填充間隙（Ludtke et al.，1995）。先前已強(qiáng)調(diào)了由magainin形成的孔隙的瞬時(shí)性質(zhì)（Matsuzaki等人，1995b）。膜的局部和瞬時(shí)破壞可能需要肽與靶細(xì)胞膜的不對(duì)稱結(jié)合。因此，在magainin與靶細(xì)胞質(zhì)膜雙層的外小葉結(jié)合后，該外單分子層的側(cè)壓力比內(nèi)小葉增加。此外，平行于層平面的=-螺旋的表面位置在外層單層中施加曲率應(yīng)變，導(dǎo)致正的自發(fā)曲率。當(dāng)兩個(gè)小葉之間的側(cè)壓差大小和與正自發(fā)曲率相關(guān)的能量超過(guò)膜變形所需的能量時(shí)，雙分子層不穩(wěn)定，肽相對(duì)于層平面的垂直方向發(fā)生重新定向，孔隙打開(kāi)。這些孔隨后可能在靶體內(nèi)聚集成超分子結(jié)構(gòu)，如在巨型脂質(zhì)體中觀察到的（圖6）。因此，孔隙和不穩(wěn)定狀態(tài)將是暫時(shí)的，允許雙層愈合。為此，馬格蛋白2在其序列的中間含有一組正電荷。同樣，當(dāng)該肽在雙層中形成瞬時(shí)孔并垂直于膜平面定向時(shí)，這些陽(yáng)離子殘基也可能靜電結(jié)合到PG，類(lèi)似于此處提出的吲哚肽組織（圖9）。原核細(xì)胞和真核細(xì)胞膜脂質(zhì)成分的主要區(qū)別在于后者富含膽固醇（Op den Kamp，1979）。上述機(jī)制也將與膽固醇的存在相兼容，以防止magainin 2的膜擾動(dòng)作用。更具體地說(shuō)，膽固醇在人類(lèi)質(zhì)膜的兩個(gè)小葉之間轉(zhuǎn)移（觸發(fā)器）非常快（Lange et al.，1981）。因此，這種膽固醇的快速易位可以消除在magainin 2結(jié)合到后一單層后靶膜內(nèi)外小葉側(cè)壓力的差異。因此，與細(xì)菌靶點(diǎn)相比，這種肽在真核細(xì)胞中產(chǎn)生毒性作用需要大量的magainin 2（Zasloff，1987）。據(jù)估計(jì)，真核細(xì)胞質(zhì)膜外小葉的平衡側(cè)壓力約為32 mN/m（Demel等人，1975年）。在超過(guò)34 mN/m的壓力下，觀察到吲哚西丁高效滲透到單層中，這可能部分解釋了該肽在真核細(xì)胞中的溶解作用。此外，哺乳動(dòng)物質(zhì)膜的外小葉僅由兩性離子磷脂組成，而細(xì)菌膜含有大量帶負(fù)電的PG（Op den Kamp，1979）。因此，由于缺乏負(fù)電荷和高壓，預(yù)計(jì)magainin 2與真核細(xì)胞質(zhì)膜的相互作用較弱，而更有效的插入吲哚肽將能夠干擾真核細(xì)胞雙層的組織。因此，脂質(zhì)特異性可能導(dǎo)致這兩種肽的不同毒性。

結(jié)論

由于抗菌肽的詳細(xì)作用機(jī)制尚待闡明，比較兩種結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的肽吲哚肽和馬蓋寧2對(duì)模型生物膜的影響很有意義。盡管它們的構(gòu)象不同，且前者的長(zhǎng)度約為后者的一半，但它們也具有諸如凈正電荷和兩親性等特征，導(dǎo)致它們與磷脂膜結(jié)合。酸性磷脂進(jìn)一步增強(qiáng)了這種相互作用，這可能對(duì)它們的抗菌活性很重要。酸性磷脂是這些肽囊泡形成巨大脂質(zhì)體所必需的，它們都會(huì)導(dǎo)致酸性磷脂分離，將它們絡(luò)合成超分子簇。同樣，這兩種肽都增加了酰基鏈順序。所有這些作用都與抗菌作用所必需的協(xié)同膜結(jié)合相一致，可能涉及肽的瞬時(shí)跨膜定向。還可能是，它們的抗菌作用需要目標(biāo)膜最初不對(duì)稱地暴露于這些肽中，并與系統(tǒng)放松回到熱力學(xué)平衡有關(guān)。